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在開始RT-PCR定量檢測之前，請閱讀關于PCR的實驗方案和操作建議。RNA的純度和完整性是合成全長cDNA的關鍵。RNA的質量受RNase A的影響，RNase A是一般實驗室環境中存在的非常穩定的污染物。因此，從事RNA研究時，需要時刻考慮到RNase污染的問題。所有Thermo Scientific應用于逆轉錄反應的產品(包括酶、緩沖液、水、核苷酸和寡核苷酸)經嚴格測試均不含RNase污染。 為防止污染這些高質量的組分，實驗室環境和所有自制溶液也必須無RNase污染。

避免RNase污染的常規操作建議：
• 用DEPC處理所有在cDNA合成中將要使用的試管和槍頭，或使用經過認證的無RNase的實驗室器具。
• 使用RNA工作的移液器。
• 操作RNA和所有試劑時需佩戴手套，因為皮膚是RNase的主要來源。經常更換手套。
• 使用鑒定合格的試劑，包括高質量的水(如DEPC-treated water)。
• 使用RNase抑制劑來穩定RNA，例如RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381)。
• 進行cDNA合成前，要求對RNA的完整性進行鑒定。
• 例如，如果在總RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳中，人的18S rRNA(分子量約1.9kb)和28S rRNA(分子量約為5kb)都形成了非常窄的條帶，則認為該樣品中的mRNA是完整無缺的。

RT反應混合物的組分
模板RNA
       標準方法分離的細胞總RNA，可與Thermo Scientific逆轉錄酶或*鏈cDNA合成試劑盒一起成功使用。純化的RNA要求無鹽、金屬離子、乙醇和酚殘留，以避免在逆轉錄反應期間
產生抑制作用。另外，RT-PCR的模板RNA必需無DNA污染，以避免PCR或qPCR出現假陽性結果。推薦使用DNase I，RNasefree(#EN0521)除去制備的RNA中痕量的DNA殘留。設置RT-PCR對照反應，對照組中模板是未經逆轉錄的RNA。

從制備的RNA中除去基因組DNA：
1. 在RNase-free的試管中加入以下組分：
 

2. 37℃孵育30分鐘。
3. 加入1μl 50mM EDTA后，65℃孵育10分鐘。無螯合劑存在時加熱將促使RNA水解2?；蛘呤褂梅?氯仿抽提RNA。
4. 所制備的RNA可用作逆轉錄的模板。

備注：
• 每μg RNA，不要使用超過1U的DNase。
• 如果有大量RNA，可以將反應體系放大。
• 推薦的RNAzui終濃度為0.1-0.2 μg/μl。
• RiboLock RNase Inhibitor(#EO0381)也可以加入到反應體系中，抑制可能存在于起始RNA溶液中的RNase A。推薦使用濃度為1U/μl。

引物
        oligo(dT)18、隨機引物或基因特異性引物均可用于*鏈cDNA的合成。Oligo(dT)18引物從真核mRNA 3’-末端的Poly(A)尾開始合成cDNA。而隨機引物，如六聚體引物，可以從所有類型RNA（rRNA和mRNA）開始進行cDNA合成。因此，使用隨機引物合成的cDNA比使用Oligo(dT)18引物合成的cDNA更加復雜，可能降低接下來PCR反應的靈敏度和/或特異性。然而，隨機引物可以優先應用于以下幾種情況：使用無poly(A)尾的真核生物mRNA進行cDNA合成，或使用富含poly(A)的RNA模板進行cDNA合成，以及進行長片段mRNAs 5’-區域的RT-PCR?；蛱禺愋砸餅閏DNA合成提供了zui高的特異性，引物由用戶自己制備。

逆轉錄酶
       所有的Thermo Scientific 逆轉錄酶均適用于全長*鏈cDNA合成，但逆轉錄酶在反應溫度、可轉錄的RNA量、靈敏度和RNase H活性方面有所不同。每種酶推薦使用的反應條件請
參見《使用RNA作為起始材料：用于RT-PCR和RT-qPCR的Thermo Scientific解決方案 》

*鏈cDNA的合成
下面列出了使用RevertAid H Minus Reverse Transcriptase進行*鏈cDNA合成的實驗方案。使用其它種類逆轉錄酶的相應反應條件，請參見第56頁的逆轉錄酶選擇表。Master Mix
為了準備多個平行實驗并zui大程度減少加樣誤差和污染，先將除了RNA和引物之外的所有反應組分預先混合制備RT master mix。制備足量的master mix(足夠用于所需反應并多配制一份以補償加樣誤差)。將模板RNA加入到各個試管中，并置于冰上。將所制備的master mix等分加入含有RNA的試管中。各組分自冷藏取出后，融化混勻并短暫離心，冰浴放置。

1. 按以下順序在無菌、nuclease-free的試管(冰浴放置)中加入以下組分：
 

2. 任選：如果RNA模板GC含量高，或含有二級結構，則需要輕輕混勻，短暫離心，65℃孵育5分鐘后在冰上急冷，短暫離心后冰浴放置。
3. 按順序添加下述組分，或制備master mix：
 

4. 輕輕混勻并短暫離心。
5. 如果引物為 oligo(dT)18 或基因特異性引物，反應條件為42℃孵育60分鐘。如果使用隨機六聚體引物，則在25℃孵育10分鐘后，再在42℃孵育60分鐘。對于GC含量高的RNA的轉
錄實驗，可將反應溫度升高到45℃。
6. 反應液70℃加熱5分鐘以終止反應。

備注
• 逆轉錄產品可直接用于PCR中，或在-20℃下儲存。
• 在50μl PCR反應體系中，使用2μl 逆轉錄反應混合物。

qPCR優化指南